猪典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

来源:《江西种地学报》2019年第02期

非洲猪瘟无药无疫苗，PCR检测如何实现早期预警？

摘要:为建立一种飞迅速、 准确检测猪典型性瘟病毒的方法，本文琢磨了非洲猪瘟病毒的特征、传播途径和症状，并详细介绍了实时荧光PCR手艺的原理和操作步骤，包括样品采集、DNA提取、反应体系配置、上机扩增等环节。还有啊，还对检测后来啊进行了判定和处理，旨在为养殖场给有效的非洲猪瘟早期预警和防控手段。

1.

非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒引起的烈性传染病，对全球养猪业造成了巨巨大吓唬。ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属， 基因组为线性双链DNA结构，病毒颗粒直径范围在175～215 nm之间。该病毒基本上在猪体内的细胞质中进行复制，尤其偏优良定位于网状内皮细胞和单核巨噬细胞。ASFV的潜伏期受毒株特性、 宿主状态以及感染途径等许多种因素关系到，通常为5～19 d，但有时可延长远至21 d。

由于ASFV无药可治、无疫苗可防，严格的生物平安建设是防控该病独一个有效的措施。所以呢， 养殖场防控非洲猪瘟的核心策略在于主动实施病原监测，及时识别病毒吓唬，从而实现早期预警、精准防控和凶险可控的目标。

2. 非洲猪瘟病毒特征、 传播途径和症状

2.1 非洲猪瘟病毒特征

ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是该病毒属的代表性病原体。其基因组为线性双链DNA结构，长远度约为170～190 kb。成熟的病毒颗粒直径范围在175～215 nm之间，表面包裹有囊膜结构。ASFV基本上在猪体内的细胞质中进行复制，尤其偏优良定位于网状内皮细胞和单核巨噬细胞。

2.2 非洲猪瘟病毒的传播途径

ASFV的传播存在许多种途径。一方面 可如何实现早期预警？" src="/upload04/09fde7a962bf64cd"/>

2.3 ASF的症状

ASF临床表现可分为Zui急性、急性、亚急性和磨蹭性。猪只过世率因感染的毒株不同而有所差异， 感染高大致病性毒株过世率可达90%～100%，Zui急性常无明显临床症状一下子过世。中等致病性毒株在感染猪只的月龄不同而弄得过世率有所差异， 成年猪的过世率在20%～40%，幼年猪过世率在70%～80%之间。矮小致病性毒株过世率虽在10%～30%间， 但会使被感染猪只渐进性消瘦，虚没劲，发育迟缓，关节肿胀和皮肤溃疡等症状。

3. 实时荧光聚合酶链反应

3.1 实时荧光PCR原理

实时荧光PCR是一种在PCR体系中加入荧光标记物，手艺。该手艺通过绘制实时扩增曲线，Neng够实现对样本中初始模板DNA的定量琢磨。

3.2 实时荧光PCR操作步骤

3.2.1 样品采集、 保存和运输

活猪样品可采集鼻咽拭子、无菌采集抗凝血或按常规方法分离血清。病死猪或屠宰猪样品可无菌采集脾脏、淋巴结、肾脏、肌肉等组织样品。周围样品包括粪便、相关区域饲料及污水等，采集后需在2～8℃的矮小温周围中保存并运输至试试室。

3.2.2 DNA提取

根据说明书用商品化核酸提取试剂盒对处理优良的样品进行核酸提取， 提取优良的DNA应尽迅速进行PCR扩增，若需长远期保存须放置在-70～-40℃以下冰箱。

3.2.3 反应体系配置

将八连管Zuo优良标记放入实时荧光PCR仪内，记录优良样本摆放顺序。选择FAM通道，并按试剂说明书设置反应参数。一般反应参数设置为：第一阶段， 预变性95℃ 3 min；第二阶段，95℃ 10 s，60℃ 30 s共45个循环、荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。

3.2.4 上机扩增

将配置优良的反应体系轻巧弹混匀， 瞬时离心，分装至八连管中。然后将Yi提取DNA的待检样品、 阴性对照和阳性对照分别加入相应的八连管中，扣紧管盖后瞬时离心，排除反应液中气泡。

4. 后来啊判定与处理

4.1 阳性判定

被检样品CT值≤35且呈现特异性扩增曲线者，判定非洲猪瘟病毒核酸阳性。

4.2 阴性判定

被检样品无CT值或CT值≥40且无非特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

4.3 疑似判定

30＜CT值＜40且呈现特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸疑似。

4.4 后来啊处理

在养殖场的自主监测中， 若生猪样品检测呈非洲猪瘟病毒核酸阳性，但存栏生猪群体未kankan到疑似临床症状，则此阳性后来啊属于自主监测阳性。应马上上报养殖场所在地县级以上动物疫病防病控制机构进行复检，并Zuo优良隔离kankan和全面消杀干活。

5. 结论

实时荧光PCR手艺具有高大度的特异性和敏感性， Neng够飞迅速、准确地检测出非洲猪瘟病毒的存在。养殖场可利用该手艺进行自主监测，及时识别病毒吓唬，实现早期预警、精准防控和凶险可控的目标。还有啊，养殖场还需加有力生物平安建设，严格施行各项防疫措施，以少许些ASFV的传播凶险。